TA克隆廠家

TA克隆廠家實驗原理　

  TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉移酶活性，而不具有3 一5外切酶的校準活性，即在PCR產物的兩個3 末端加上未配對的單一A凸出尾 ，質粒載體提供線性3末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產物高效連接。TA克隆技術比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

TA克隆只需4個步驟：①擴增目的PCR產物；②制備T克隆載體；③PCR產物直接克隆至T載體上④轉化并篩選重組子。

TA克隆廠家（clone）：無性繁殖——應用酶學的方法，在體外將目的基因與載體DNA結合成具有自我復制能力的DNA分子（重組子），再通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因轉化子，進行擴增、提取獲得大量同一DNA

實驗步驟

（1）擴增后的PCR產物與T載體的連接

取1只無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR產物約0.3 pmol

T載體約0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA的摩爾數應控制在載體DNA摩爾數的3－10倍。

*2 相同末端的載體與DNA進行連接時，應首先將載體進行去磷酸化處理，以防止其自身環化。

（2）蓋好蓋子，用手指輕彈Ep管數次，并于臺式離心機離心2s 以集中溶液。

（3）將反應管放入4℃金屬浴中反應20h。

（4）取出約2ul的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定連接結果，與未經連接的質粒DNA和酶切DNA一同作電泳。

（5）用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul，使用10ul轉化大腸桿菌感受態細胞。

（6）通過Amp抗性來篩選轉化子，轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。