上海RNA抽提

上海RNA抽提操作步驟:

　　1. 勻漿處理:

　　a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

　　b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

　　c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

　　2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物*分離。

上海RNA抽提可分為信使RNA、轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取實質(zhì)就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì)，zui終獲得高純RNA產(chǎn)物的過程。 由于RNA樣品易受環(huán)境因素特別是RNA酶的影響而降

可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

　　1、劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

　　2. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

　3. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

　4. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。